长链非编码RNA（lncRNA）指长度超过200个核苷酸的转录异质物，一般不编码蛋白质。目前已经提出lncRNA通过充当信号传导、引导、隔离或支架分子来影响邻近或远距离基因的表达。

许多研究发现一些lncRNA在计量补偿效应、印记以及发育中有重要作用，然而也有一些突变实验质疑这些lncRNA实验结果。

这些相互矛盾的研究，引发了lncRNA对脊椎动物发育重要性的争议。

近日，哈佛大学Mehdi Goudarzi等人在Elife杂志发表题为：Individual long non-coding RNAs have no overt functions in zebrafish embryogenesis, viability and fertility的研究论文。

该研究通过CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼的lncRNA，发现单个的lncRNA在胚胎发育、生存力和生育力等方面都没有作用，一些之前认为有功能的非编码RNA的作用也是可有可无的。

早期胚胎发育和成体组织的转录组学研究已经鉴定了斑马鱼中超过2000种lncRNA，其中727基于核糖体占据模式被确认为非编码。

为了研究lncRNA在脊椎动物发育过程中的作用，该研究根据序列保守性、表达谱、与发育调控基因的接近度选择了24个真正的lncRNA和1个具有非编码功能的编码基因。（图1）

图1：这25个基因，以及它们在染色体上的位置

使用CRISPR-Cas9基因编辑产生了32个敲除等位基因。24个等位基因去除了含有转录起始位点的区域（敲除长度为244 bp-736 bp)，8个等位基因完全或部分去除了整个基因（敲除长度为1kb-203kb)。qRT-PCR分析显示这些lncRNA转录水平均有效降低（平均降低94±6％）。

以LncRNA-gas5为例，gas5是进化上保守的lncRNA，其在早期发育中高度表达，之前针对gas5的敲减或敲除实验表明，gas5可能作为肿瘤抑制因子，并在远距离基因组位点发挥作用。

本研究通过敲除gas5转录起始位点，使gas5得表达完全消失，发现gas5得临近基因——编码脂质结合蛋白得osbp19的表达增加了50％。但后续检测发现胚胎发生，生存力或生育力都没有发现什么变化。（图2）

图2：gas5的敲除实验

其他lncRNA得敲除实验结果也类似，观察到一些敲除后得突变体中邻近基因的转录改变，但胚胎发生，生存力或生育力都没观察到变化，表明这些生理过程并不需要lncRNA参与。

但有一个例外情况，敲除lnc-phox2bb基因全长后，斑马鱼发育出现问题，且不能存活到成年。

lnc-phox2bb与phox2bb和smtnl1这两个基因相邻。Phox2bb是一种与交感神经系统发育有关的转录因子，smtnl1与平滑肌收缩有关。

lnc-phox2bb的全基因缺失导致斑马鱼颌骨变形并且不能使鱼鳔膨胀，并且没有纯合突变体鱼存活至成年。

转录起始位点缺失得lnc-phox2bb跟全长缺失一样，都不表达mRNA，但转录起始位点缺失突变体正常发育并并且可育。

为了确定这种差异的原因，该研究分析了其相邻基因的表达水平和模式，发现在lnc-phox2bb整个基因缺失突变体中没有phox2bb的表达。因为lnc-phox2bb全长片段中含有phox2bb的增强子元件，还发现lnc-phox2bb整个基因缺失突变体中smtnl1的表达水平增加。（图3）

这些结果表明，正常发育不需要lnc-phox2bbRNA，但是lnc-phox2bb与正确表达phox2bb和smtnl1所需的调节元件重叠。

图3：lnc-phox2bb的敲除实验

总的来说，该突变研究表明，这里分析的25种lncRNA中没有一种对胚胎发育、活力或生育能力有重要作用，包括之前认为有重要作用的lncRNAs cyrano、gas5和lnc-setd1ba等。

但这些表型筛选不能排除更微妙的表型，例如，在行为或大脑活动中反应的表型变化。但至少说明，大多数斑马鱼lncRNA在胚胎发育、活力或生育能力并无作用。

BioWorld：这项研究暗示了许多lncRNA相关研究中发现的表型变化，很可能是lncRNA表达变化引起了临近基因表达改变导致的。因此为了研究的严谨性，lncRNA功能缺失实验应使用多种不同的缺失手段，并检测临近基因表达变化，进行Rescue实验等，更严谨地验证lncRNA功能。

论文链接：https://elifesciences.org/articles/40815